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          獲得高質量土壤RNA的10個建議

          來源:深圳市安必勝科技有限公司 轉載請注明出處【字號:

          前面的文章我們介紹了如何提取土壤DNA。大篇幅詳細講解了影響DNA得率和純度的研磨均質、化學試劑(重點是裂解緩沖液)等問題。做DNA遠沒有做RNA壓力大。不用太擔心降解,得率還挺高。

          RNA就不一樣。。。

          提取土壤RNA是環境分子生物學研究最難的研究方法之一。RNA提取本身就是件艱巨的任務,提取土壤的RNA挑戰更大。最大的困難之一是土壤RNA得率。從土壤中獲得RNA遠比DNA少,前者僅有后者的10-20%,所以需要比提DNA更多的加樣量。因此需要用更大的研磨管(15ml)和更大的離心機。

          另一個大問題是腐植酸等抑制因子的污染。RNA實驗對純度要求很高,當逆轉錄尋找低拷貝數基因時,你無法稀釋RNA樣品。要求加入反應體系中的RNA濃度足夠高且不能含有抑制因子。

          提取土壤RNA需要特殊條件

          因此,MO BIO開發出了一套不使用二氧化硅離心柱的方法來提取土壤RNA。下面討論關于RNA PowerSoil Kit以及何如獲得更好的提取效果。

          這套操作流程包含了多種方法。IRT技術去除抑制因子,酚氯仿法最充分地裂解微生物細胞,陰離子交換技術更高的純化質量。最終獲得非常干凈的RNA最大化地滿足RT-PCR的需要。

          讓我們一起來討論如何使用這些技術,并盡可能少出錯返工。每個土壤樣品質地、水分含量、微生物豐度都不一樣,在提取過程中出現的狀況不盡相同。下面我們重點討論幾個容易出錯的關鍵步驟,以及做哪些修改可以獲得更好的提取效果。

          1. 樣品起始量

          對于絕大多數類型土壤,2g土壤是最大的樣品起始量。然而,對于底泥這類含水量較高的土壤,本身實際土壤含量較低,微生物含量也不高,我最多用到5g的起始量。如果樣品加入到研磨珠套管后,發現上面有一層水。最好先離心并吸去多余的水分。

          2. 酚氯仿異戊醇Phenol: Chloroform(步驟3):

          使用正確的PCI非常重要,在試劑盒操作說明書中我們給出了一些使用建議。PCI比例必須為25:24:1,pH介于6.7-8,并保存在pH8.0的TE緩沖液中。許多人提取動物組織和細胞習慣性地只使用低pH值的苯酚來提取RNA。而對于土壤,pH中性的苯酚會合適。

          3. 優化異丙醇濃縮(步驟9):

          PCI裂解步驟后加入SR3溶液,下一步加入異丙醇沉淀總核酸。如果你在做底泥,加完SR3溶液后總體積可能超過5ml。增加SR4(異丙醇)的使用量,至與步驟8獲得的樣品體積相同,以保證充分沉淀核酸。

          4. 異丙醇沉淀的環境溫度(步驟9):

          原有的操作說明建議-20℃冷凍樣品。鹽濃度高的樣品核酸沉淀步驟請在室溫下進行。冷凍樣品沉淀的鹽分,會改變陰離子交換離心柱上的核酸吸附綁定條件。你可以從沉淀物中看出來是否有鹽分沉淀。正常的RNA沉淀表面平坦有光澤,若沉淀明顯較大且表面有殼,表明有鹽分沉積。底泥樣品水分大,就算是淡水湖也好,多余的水分會含鹽。若你的土壤類型在-20℃下孵育能獲得更理想的得率,請按照原方法進行。

          暫停點:我曾經把步驟9的孵育時間延長超過30min,甚至過夜,最終RNA依然完好。我不建議每個樣品都延長孵育時間,至少你的土樣樣品需要測試才能知道是否影響RNA質量。只在特殊情況下,你可以稍微在此步驟暫停。

          5. 陰離子交換離心柱溶液自然滴下(步驟14)

          最后的RNA回收步驟使用的離心柱裝有樹脂,溶液利用重力通過離心柱。有時溶液通過樹脂的速度很慢,可適當施加正壓加速流動。通常我們的做法是用5ml注射器針管緩緩加壓,但流速不應該超過1滴每秒。

          6. 搖、搖,搖勻SR5和SR6(步驟12):

          SR5和SR6使用前必須充分搖勻。有些含有異丙醇的溶液靜置會分層,使用前只要充分搖勻即可。

          7. 節省洗提時間小提示(步驟16-20):

          有時候我會直接洗脫到2ml Collection Tube,而不用15ml Tube。確保離心柱垂直放置不會傾覆。只有摸透了技巧才好這么弄,謝絕新手。

          8. 最后異丙醇沉淀(步驟17):Final isopropanol precipitation (step 20):

          從離心管中洗脫下來以后,加入異丙醇(SR4溶液)做最終沉淀。需要在-20℃孵育。此步必須在-20℃孵育(VS 室溫)。此步可適當延長時間。

          暫停點:若提取工作沒辦法繼續完成,可在此步暫停過夜。樣品在-20℃冷凍,RNA能穩定保存。

          9. 沉淀RNA(步驟18):

          離心異丙醇分離RNA,正常RNA沉淀應小而呈玻璃光澤。離心時所有的Tube管要朝向一致,以便于倒出異丙醇時迅速辨認RNA沉淀。晾干RNA沉淀步驟需要快速完成。通常我們的做法是在超凈臺中把Tube管倒置在吸水紙上。

          10. 重懸RNA(步驟20):

          現在,你有了漂亮的干燥沉淀。根據逆轉錄對體積的要求,重懸RNA。在我們實驗室里頭,若樣品土壤微生物非常豐富,我們會用50-100μl水重懸(通常最終濃度為100-20ng/μl)。底泥或干燥土壤微生物含量低,為了提高最終RNA濃度,我們用25μl水重懸。這一步可操作性很高,請根據你的需要加入適合的水量重懸沉淀。

          額外提示:

          用SR6溶液洗脫RNA以后,離心柱濾膜還有DNA在。你可以用含有高濃度鹽的SR8溶液(DNA Elution Accessory Kit組分)把基因組DNA洗脫下來。因為整個核酸提取過程動作相對溫和,你可以獲得更大分子量的DNA。陰離子交換離心柱的又一優勢在于,你可以從同一個樣品中先后提取到RNA和DNA。

          再一個額外提示:RNA穩定性和土樣保存:

          我們常被問到采樣后土樣中RNA的穩定性,以及RNALater的使用。事實上RNALater并不兼容土壤。我們做過用RNALater在不同溫度和時間下對土壤RNA的保護試驗,結果發現隨著保存時間的延長,RNALater會令土樣釋放出更多的腐植酸,粘附在RNA上與RNA共同吸附于陰離子交換離心柱濾膜上難以去除。保存的時間越長,樣品顏色變得越深。

          我們采樣時使用LifeGuard Soil Preservation Solution對土壤RNA進行保護,并且在運輸過程中能保證微生物結構穩定不變。

          總結:

          最具挑戰性的樣品提取就是土壤RNA。樣品中RNA非常不穩定、含量很低,而且存在大量抑制因子和微生物源RNase。但是獲得高得率干凈RNA還是可以做到的。我希望以上十點小技巧能縮短你提取新土樣RNA的摸索過程。要是你有更多提取訣竅,不妨告訴我們。我們樂意聽到研究者通過某些步驟特定的修改獲得他們想要的結果。

          產品鏈接:RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit

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