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          DNA純化去雜質

          來源:深圳市安必勝科技有限公司 轉載請注明出處【字號:

          這周我們來討論一項常用的技術,即使常用但仍引起部分人核酸分離焦慮癥。那就是基因組DNA的純化去雜質。

          場景是這樣的:你有一份采自南太平洋中部一個偏僻小島上首次發現的古老蘭花品種根際土壤樣品。你使用了非PowerSoil Kit法提取其中的微生物DNA。最終DNA含有太多雜質,無法PCR擴增。因此需要去除腐植酸等PCR抑制因子。你需要所有的核酸分子通過全基因組鳥槍測序……怎么辦?

          你致電MO BIO說了你的大概情況,而我們推薦了使用PowerClean Kit。PowerClean是不帶研磨珠套管的迷你版PowerSoil Kit。樣品經過了IRT處理,重新洗脫得到干凈的DNA。等等…分光光度計讀數發生變化了!純化前顯示有300ng/μl的DNA,現在卻只有30ng/μl。有比這更可怕的噩夢嗎?你的DNA大量丟失了!

          先別急?梢愿嬖V你,你的DNA現在是安全并且干凈的。使用實驗室常規方法純化DNA前后到底發生什么事,下面向你解釋:

          我想先回到之前寫的一篇關于環境樣品粗提DNA中雜質誤導UV260得率檢測結果的文章。這點非常關鍵,因為伴隨土壤、水樣、生物薄膜、植物組織等樣品一起被提取出來的有機抑制因子會影響波長260測量DNA得率讀數的準確性(也抑制PCR擴增)。如果采用CTAB法或苯酚氯仿法提取,降解的小分子RNA也會影響讀數。沒有使用抑制因子去除技術的硅膠離心柱型試劑盒、使用強力綁定鹽溶液無差別地綁定吸附DNA和RNA等因素同樣影響得率檢測數據。

          好消息是,一旦這些影響因素被去除,最新的讀數才代表真正的得率

          下面我們來看一下在實驗室常規檢測手段(分光光度法和瓊脂凝膠電泳)下DNA的情況是如何被展示的。我們從分光光度法開始,下面展示了幾個使用及未使用IRT技術提取的土壤樣品結果。首先注意到的是DNA得率讀數ng/ul。這個讀數很重要,但也只是告訴你事實的一小部分。。

          縱覽整個表格

          260/230比率告訴我們這個DNA有問題。讀數低于1.0,表示含有高水平的抑制因子。我們還能從320讀數中看到另一個重要的信息。與下列的樣品相比,上面的樣品讀數高出10倍。腐殖酸在波長320吸光度最強,因此340處的高吸光度值表示最終DNA中含有大量腐殖酸。260/230比值,加上較高的320吸光度,表明DNA很不干凈,且是由有機雜質引起的。

          吸光光度法提供了所有波長下的數據。我們能清楚地看到在整個波段檢測中雜質的情況。讀數開始很高并持續放大。曲線的中部抑制因子集中的地方260讀數一直高于正常位置。

          但是,這還是很難讓所有人相信,最終溶液中并不全是DNA。所以,最好的確認結果的辦法是瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖中有分光光度法無法看到的信息,DNA的完整性和直觀的得率,F在我們看到的情況完全不一樣。雖然分光光度法顯示未使用IRT技術的DNA得率是使用了IRT技術得率的兩倍,而電泳圖上它卻沒有跑出相應多的DNA。雜質干擾了分析結果。這就是為什么我們常常建議同時用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳或picogreen檢測DNA。

          那使用PowerClean Kit純化粗提DNA過程中發生了什么事?你去除DNA中的雜質成分,結果得率讀數下降了。有些時候讀數能下降多達50%。但大分子DNA并沒有損失。丟失的只是你不想要的雜質部分,討厭的PCR抑制因子浪費你的時間和金錢,F在DNA總算干凈了。

          讓我們再深入了解第二個誤導DNA得率的東東:RNA

          許多提取方法會把RNA連同DNA一起提取出來。雖然這部分RNA分子并不完整,但仍會吸收UV。使用苯酚和氯仿提取核酸,以及等份強綁定鹽溶液、酒精吸附DNA法都會把RNA提出來。因為分光光度法并不能區分DNA和RNA。這就是為什么只檢測DNA部分的Picogreen法結果會更準確。瓊脂糖凝膠電泳能直觀地看到RNA彌散帶,對結果判斷更有幫助。

          在這個例子中我們提取了過夜孵育的大腸桿菌純培養,每樣4ml。從電泳圖上能清晰看到底部彌散的降解RNA(條帶4-6)。分光光度法和Picogreen讀數對比結果列在了右邊。Picogreen的結果顯示,DNA的得率要比分光光度法讀數低60%。有些樣品RNA能推高讀數高達70%。如此大的誤差必定會對后續實驗結果產生影響。

          好消息是,MOBIO的試劑盒設計上只綁定DNA,不吸附RNA。從上圖結果看來,確保了分光光度法讀書的準確性。根據需要,通過調整綁定條件還能增加或減少小片段核酸或RNA的捕捉效率。

          所以,總結最后:做純化前后給DNA跑電泳。檢查濃度(得率)和完整新(DNA分子量大。,并與備用檢測方法(分光光度法或Picogreen)做對比檢查是否存在RNA或抑制因子。

          開展后續實驗前對DNA樣品做個簡單的檢查可節省你的時間,減緩焦慮情緒。請記住,試劑盒只能你給什么,他們出什么。你要的是干凈的DNA。事先知道你有多少DNA,對最終出來的DNA有個大概估計,做到心中有數。

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