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          DNA提取 I:土壤的分子生物學特性

          作者:Suzanne kennedy 來源:美國MoBio實驗室【字號:

          在前面的文章(Soil molecular biology),圍繞提取土壤樣品DNA、RNA相關問題做了簡單的引導介紹,比如PCR抑制因子、裂解注意事項等。今天將詳細介紹土壤微生物DNA提取的細節,以及如何使用MO BIO PowerSoil® DNA Isolation Kit獲得更好的提取效果。

          鑒于細節內容篇幅較長,此文章將分成兩個部分。第一部分著重介紹研磨均質使用的研磨珠、研磨設備和裂解緩沖液。第二部分介紹選擇化學溶液以獲得最好的DNA吸附綁定、清洗和抽提效果。

          MO BIO實驗室用于提取土壤DNA的試劑盒有好幾種。而PowerSoil DNA Isolation Kit 是效果最好,最受歡迎的一個。因此,在下面文章了將主要針對它來討論。此試劑盒采用了專利的抑制因子去除技術(IRT技術)來去除多糖多酚等腐植質,使用了小型的離心過濾柱和微型離心機。

          需要注意的是,不同土壤微生物含量和有機物含量差異很大,DNA得率也就有差別。得率不單單是由樣品起始量來決定,來自同一塊泥土不同土層深度的樣品微生物含量、有機物組成也會大不同。

          想保證每個樣品得率一致很困難,因為每鏟泥土可能含有不一樣多的樹葉、殘骸、昆蟲,甚至小石子、沙子。在MO BIO實驗室里,我們通常要對土壤樣品進行過篩,去掉大塊,保證每個樣品質地一致。如果樣品的一致性對你的實驗影響比較大,過篩是必須的。

          這點很重要,加大樣品起始量,并不總是意味著可以獲得更多的DNA。因為太多的樣品會吸收掉大部分裂解緩沖液,使得研磨效率驟降。加大樣品起始量只能對個別類型土壤來說可行。PowerSoil DNA Kit 是小量提取試劑盒。如果你需要提取多于0.25g的土壤,MO BIO提供了像PowerMax® Soil DNA Kit這樣提10g土壤的,RNA PowerSoil® Kit和配套的DNA Elution Accessory Kit一次提取2g土壤。

          接下來,我們順著DNA提取過程一步一步講解。首先是裂解,尤其是機械法裂解。

          步驟一:裂解:

          獲得高得率完整DNA需要強而有力的裂解。選擇研磨珠種類以及機械研磨時間需要掌握一個平衡,使得在打開微生物細胞的同時盡量減少對DNA的剪切破損。使用研磨珠擊打破碎若配合溫度改變,可以強化裂解作用,對于堅硬的有機物和孢子等的裂解有很大幫助。

          研磨珠類型:

          適合裂解土壤微生物的研磨珠有很多種。研磨珠的類型,外形,大小都會影響到DNA的得率和完整性。

          MO BIO偏向喜歡用大小不一、邊緣鋒利的石榴石研磨珠。就因為研磨珠大小不一,既可以打碎大塊泥土,也可以照顧到小小的微生物細胞。石榴石質地較軟,在使用高速珠磨研磨機的時候會崩裂成很多小塊。許多客戶為了加強提取真菌DNA的機械裂解力,而在FastPrep o或Precellys上使用,也能獲得很好的效果。

          高速強力珠磨設備長時間擊打研磨,需要使用0.5mm或0.1mm玻璃研磨珠。雖然這類研磨珠會加重DNA破損,但是用于孢子類堅硬有機物的裂解是有幫助的。你也可以混合使用大小不一樣的玻璃和石榴石做一個適合自己樣品的研磨珠混搭。

          研磨設備:

          前面文章也提到過,渦旋儀研磨法是獲得完整DNA最省錢的研磨方法。實驗證明,配合我們的裂解緩沖液處理0.25g土壤樣品,10min的渦旋時間是最合適的。延長渦旋時間并不能增加得率,反而讓DNA破損增大。

          Precellys 或 FastPrep也是個不錯的選擇,如果你的實驗室有,并希望加強裂解效果。大多數客戶提取細菌、真菌DNA的時候,把FastPrep調到5檔,研磨45s到1min。FastPrep上的5檔相當于Precellys的5200rpm。也有些客戶喜歡用4檔(相當于Precellys的5000rpm),每個樣品15-30s,3~4個循環。由此可以看到,使用強力珠磨研磨設備,還需要根據手上樣品的具體情況調整研磨方案。文章尾部列舉了一些在FastPrep上使用MO BIO UltraClean Soil PowerSoil Kits的相關文獻,供參考。

          裂解緩沖液:

          另一個組成強力裂解力量崩開細胞的重要成分是"溶液"。這個溶液必須滿足3個條件。第一,聯合機械作用力瓦解細胞膜。二,性質柔和不損傷DNA。三,不受土壤本身pH的印象。必須緩沖掉土壤本身的酸性,因為酸性條件對DNA有害。裂解緩沖液結合C1或者S1(分別是PowerSoil 和UltraClean Soil kits)提供了裂解所有類型土壤微生物的最佳條件。

          加熱?

          在需要強力裂解的情況下,撇開高速強力注珠磨研磨機和玻璃研磨珠不說,研磨前加熱樣品對于提取是有幫助的。接入裂解緩沖液以后,65℃-70℃孵育10-15min可以弱化細胞膜,利于研磨破碎。對真菌、孢子尤其有效。

          另一個方法是從-20°C 或 -80°C 到 37°C對土壤樣品反復凍融3次。此方法同樣能增強細胞的破碎。當然,實施起來就沒有上面提到的加熱法方便。

          總結:

          好了,已經說了很多?偟膩碚f,裂解步驟就是聯合研磨珠+研磨設備+緩沖液儀器對樣品進行裂解并極大程度上影響DNA的得率和完整性。各個環節都是很靈活的,你可以根據樣品的實際情況做調整。而無論提取動物組織RNA、微生物純培養DNA、生物薄膜(Biofilm)DNA或RNA,道理都是一樣的。

          還好,有MO BIO labs R & D科學家們花大量時間為做各種環境樣品提取條件的優化,反過來就是節約了您寶貴的實驗時間。

          我們沒辦法嘗試每一種土壤類型,那就需要您來告訴我們,為了獲得最佳的裂解效果,您都做了些什么?使用哪種研磨珠、多長研磨時間、使用什么研磨設備、用了MO BIO的那個盒子?

          下一篇文章里,我們將繼續討論土壤DNA提取中涉及的硅膠膜離心吸附柱。

          謝謝你們的閱讀!

          配合高速珠磨研磨機使用MO BIO土壤試劑盒的相關文獻:

          • Shifts in Microbial Community Composition and Physiological Profiles across a Gradient of Induced Soil DegradationGuilherme M. Chaer, Marcelo F. Fernandes, David D. Myrold, and Peter J. Bottomley Soil Sci. Soc. Am. J., Jun 2009; 73: 1327 – 1334.

          • Variations in Archaeal and Bacterial Diversity Associated with the Sulfate-Methane Transition Zone in Continental Margin Sediments (Santa Barbara Basin, California)Benjamin K. Harrison, Husen Zhang, Will Berelson, and Victoria J. OrphanAppl. Envir. Microbiol., Mar 2009; 75: 1487 – 1499.
          • Diversity of Basidiomycetes in Michigan Agricultural SoilMichael D. J. Lynch and R. Greg ThornAppl. Envir. Microbiol., Nov 2006; 72: 7050 – 7056.

          • Community Structure in the Sediment of a Freshwater Stream with Variable Seasonal FlowSteven A. Wakelin, Matt J. Colloff, and Rai S. KookanaAppl. Envir. Microbiol., May 2008; 74: 2659 – 2668.

          • Changes in Bacterial and Archaeal Community Structure and Functional Diversity along a Geochemically Variable Soil ProfileColleen M. Hansel, Scott Fendorf, Phillip M. Jardine, and Christopher A. FrancisAppl. Envir. Microbiol., Mar 2008; 74: 1620 – 1633.

          • Molecular Profiling of Rhizosphere Microbial Communities Associated with Healthy and Diseased Black Spruce (Picea mariana) Seedlings Grown in a NurseryM. Filion, R. C. Hamelin, L. Bernier, and M. St-ArnaudAppl. Envir. Microbiol., Jun 2004; 70: 3541 – 3551.http://aem.asm.org/cgi/reprint/70/6/3541

          • Mycobacterium aviumsubsp. paratuberculosis in the Catchment Area and Water of the River Taff in South Wales, United Kingdom, and Its Potential Relationship to Clustering of Crohn's Disease Cases in the City of CardiffR. W. Pickup, G. Rhodes, S. Arnott, K. Sidi-Boumedine, T. J. Bull, A. Weightman, M. Hurley, and J. Hermon-TaylorAppl. Envir. Microbiol., Apr 2005; 71: 2130 – 2139.http://aem.asm.org/cgi/reprint/71/4/2130

          • Molecular Fingerprinting of the Fecal Microbiota of Children Raised According to Different LifestylesJohan Dicksved, Helen Floistrup, Anna Bergstrom, Magnus Rosenquist, Goran Pershagen, Annika Scheynius, Stefan Roos, Johan S. Alm, Lars Engstrand, Charlotte Braun-Fahrlander, Erika von Mutius, and Janet K. Jansson Appl. Envir. Microbiol., Apr 2007; 73: 2284 – 2289.http://aem.asm.org/cgi/reprint/73/7/2284

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