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          生物薄膜DNA、RNA提取要點

          作者:Suzanne kennedy 來源:美國MoBio實驗室【字號:
          不同土壤樣品

          早前的文章我們討論過了生物薄膜(biofilm)樣品的基本特性以及影響樣品制備和處理方法的因素。今天我們與你分享提取生物薄膜樣品DNA或RNA的幾個要點。下面列是我們處理了大量各種類型生物薄膜和微生物墊(biomats)總結出來的,以及與我們聯合共同開發PowerBiofilm Kit的科學家的經驗。

          下面的列表會隨著對生物薄膜的繼續深入研究或遇到新類型有趣的樣品而可能增加。如果你的樣品非常難處理,聯系我們,或者可以給你好的建議。

          1)少加樣。當使用2ml Bead Tubes小量提取時,加樣量控制在0.05-0.2g。有些研究者通過自己實驗室長期摸索優化,加樣量有達到0.25-0.3g的。使用超過建議加樣量常常會導致提不到核酸(見第三點)。建議加樣量不是指導范圍而是裂解溶液化學物的最優處理范圍。過量加樣會影響生物薄膜生長基質的去除和細胞裂解。

          2)使用試劑盒提供研磨珠套管。PowerBiofilm 的研磨珠套管是經過專門設計適應裂解溶液化學物工作的。它不是簡單的研磨珠混搭。外容器Tube本身非常堅硬,可適用于普通的渦旋振蕩和強力高速珠磨研磨機,不會中途破裂。請不要把研磨珠轉移到其它Tube管中使用。有些人未曾用過不透明的研磨珠套管,不過把離心后碎片等會沉淀下來,轉移上清不會很困難。去嘗試,如果有困難請隨時聯系我們。

          3)不要超時研磨。使用你實驗室常規研磨均質設備和標準設置不一定最好,有可能過分研磨。根據我們的經驗,加長樣品研磨時間或更大的研磨強度并不能提高得率。隨著研磨時間的延長和強度的增加,多糖和其它有機/無機成分容易形成粘稠的裂解物。絕大多數這類物質不可溶,且會吸附核酸,導致核酸丟失。如果研磨完畢可轉移的裂解物少于400μl,那么就是研磨太過了。高速研磨30s比較合適。

          4)使用適量洗脫液。這條適用于使用二氧化硅濾膜過濾柱進行洗脫。最好的洗脫液體積是100μl。這個量可讓核酸充分洗脫下來。均勻加到濾膜上的話,50μl最小量也還能保證核酸洗脫效率,不過100μl能獲得最充分洗脫。使用小于50μl會嚴重影響核酸得率。請記住,稀釋的核酸可通過濃縮縮小體積。

          5)不要以為所有生物薄膜(biofilm)和生物墊(biomats)都差不多。有些生物薄膜雜質很多微生物很少,得率遠沒有想象中的那么高。若洗脫后分光光度計測不出來DNA或RNA,加樣量沒有超出建議值,也沒有研磨太過,也許只是核酸濃度非常低。你仍然有可能通過PCR檢測得到(見第六點)。若對你的生物薄膜樣品不太了解,與預期得率差異很大,請聯系我們,或者可以給出更多優化建議。關于一些生物薄膜和生物墊的常規得率,點擊這里(biofilm_apnote)。

          6)凝膠電泳和PCR共同評估核酸。使用紫外光檢測得率,許多因素會影響讀數的準確性。腐植酸和污染的RNA可明顯推高A260。DNA碎片比完整DNA片段讀數要高。凝膠電泳可更好檢驗分光光度計的結果。因為PowerBiofilm使用了IRT技術(抑制因子去除技術),獲得的核酸非常純凈,所以若讀數較低,也要比未經有效純化DNA和RNA得到的結果更準確。如果凝膠電泳看不到條帶,嘗試PCR擴增。使用了IRT技術的PowerBiofilm Kit能保證擴增的成功率,這點明顯區別于其它提取方法。

          小結:

          希望上述的幾條建議能幫助正在努力奮斗提取此珍貴樣品生物學信息的你;ㄙM大量時間和金錢長途跋涉采樣辛苦勞累,我們懂!希望你們試驗能成功。后面會發布更多技術要領。也歡迎你與我們風險處理生物薄膜的心得和技巧。

          更多


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