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          科研小技巧:如何QC RNA

          作者:Suzanne 來源:美國MoBio實驗室【字號:

          如何提取組織、細胞RNA至今仍是一個熱門話題?茖W界許多新發現有賴于半衰期僅有5秒的低拷貝mRNA。

          言歸正傳,我們前面講了已經很多基本知識。如,加入變性緩沖液后快速劇烈透徹的均質化是抑制核酸酶和最大程度釋放RNA的關鍵。還有,我們也說過不同類型樣品的均質化方法,從液氮最后說到使用大型珠磨研磨設備可以用哪些研磨珠。選用哪種方法要看手上有什么設備,以及一天內要處理多少個樣品。珠磨研磨法可一次性處理多個樣品,樣品獲得同等的裂解效率,保證均一性。樣品比較少的話,研缽加研杵或者手持電動均質器這類一次只能處理一個樣品的方法比較合適。但是每做完一個樣品都要清洗設備,就會大大增加交叉污染的風險。

          我們尚未討論過的一個話題是如何定量定性檢測RNA。準確分析RNA是保證下一步實驗獲得可重復性結果的關鍵。結果要從一開始就要保持一致。

          檢測RNA得率:

          有幾種方法可以用來給RNA做定量。最常用也最便宜的莫過于Nanodrop分光光度計等紫外光吸光度的儀器。Nanodrop還有一個好處就是能提供RNA純度信息。你可以獲知代表樣品中蛋白雜質含量的260/280比值,還可以通過260/230比值知道樣品中是否還有其它雜質(如胍酸鹽)。RNA的最佳260/280比值范圍是1.8-2.1,260/230比值最好是大于1.5。下圖是Nanodrop所能提供信息的圖標。

          需要注意的是,若RNA濃度低于特定濃度(20ng/μl),Nanodrop檢測數據將不再準確。我們發現當260濃度不能與280或230平衡的時候,比值數據就會出現異常。在這種情況下,留意Nanodrop的波形圖。確保所看到的峰值不是220-230或280。只有曲線中峰值在260,RNA才是安全的。

          為了更好地說明問題,拿一個土壤RNA實驗的圖舉例。你可以看到有兩條曲線在230處出現峰值,然后像滑雪斜坡一樣走下來。情況不妙。230處的峰值表示有鹽污染,鹽來源于硫氰酸胍之類用來裂解細胞核抑制RNase的組分。若未完全沖洗干凈,會影響整個曲線圖,260讀數虛高。

          黃色和綠色曲線是同時含有的大量鹽、腐植酸抑制因子污染的樣品。腐植酸從230處大量吸光,貫穿整條曲線至320。上四個樣品RNA剛提出來的時候都是棕色的。

          正常的圖形應該是綠色和黃色下面的曲線。在圖上往230靠近是一個很漂亮的下坡,260處有峰值,然后280處再次走下坡。然后,看最底下的紅色和黑色曲線,它們是純凈但濃度很低的RNA。230和280讀數都很低,與260比值不等于2:1。這并不意味著RNA質量不好,從圖上并未看到滑雪斜坡或者曲線走直線,RNA還是可以用的。

          低濃度RNA我們還有更靈敏的檢測方法。我們有時候會用Ribogreen Kit和Qubit機器。Ribogreen染色法的好處是它只檢測RNA。在使用極其方便的同時,它只并不能提供RNA完整性和純度方面的信息。在前面的文章里,我們已經拿質粒樣品對比討論過了紫外分光光度法和熒光燃料法定量檢測DNA的異同。要獲得比較數據,請點擊上述鏈接查看相關文章。

          檢測完整性:

          除了RNA的得率,評價RNA提取的好壞還得看完整性。完整性意味著RNA的完整或未被降解程度。通常我們會看電泳條帶中rRNA的濃度。真核細胞的28S的濃度應該是18S的兩倍,細菌要看的23S和16S rRNA條帶。只需簡單地跑一個5-10μl 樣品標準1% DNA瓊脂糖凝膠就可以。只是快速檢測RNA完整性,沒必要跑變性凝膠。下面是PowerLyzer UltraClean Tissue and Cells RNA Kit提取到的老鼠肝臟RNA電泳圖。

          肝臟RNA含量非常高,所以只加了5μl跑膠。若RNA點樣太多,反而不容易把條帶跑開。

          高質量的RNA,上層28S條帶應該比下面的18S條帶要濃2倍,而且條帶略彎和非常清晰。樣品均質化步驟做得好的話,上面的DNA在凝膠上將不會有。若28S條帶跟18S的濃度差不多,表示樣品稍微有些降解。28S與18S的模糊段是mRNA。而其它段的彌散帶不是個好現象。

          還有安捷倫的Bioanalyzer可以分析RNA的完整性。這款機器非常好用,只需要1~2μlRNA樣品,通過給出RIN數字告知rRNA條帶的大小。借此RNA Intergrity Number(RIN)數值可以直觀地比較不同樣品提取的RNA。

          這里是安捷倫Bioanalyzer分析的一份結果。該肝臟RNA樣品在分析前需要用了Eukaryotic Total RNA Nano Series II kit處理。RIN值表明了用珠磨研磨法的MOBIO UltraClean Tissue and Cells RNA Kit 提取的RNA與同樣適用硅膠離心柱的另一競爭品牌試劑盒的區別。

          Bioanalyzer圖譜的X軸從左往右,數字越大表示片段越大。45-50之間的片段是28S rRNA,41-42的是18S。如RNA出現了降解,圖上會在35-40甚至更靠前的位置出現亮點或峰值。RNA片段越大,峰值越靠右。若RNA中有基因組DNA污染,它會在右邊出現峰值。

          關于Nanodrop 和 Agilent Bioanalyzer的更多細節,已由Biomedical Genomics整理并發布在這里。

          并不是每個人都能在實驗室里開動Agilent Bioanalyzer的。機器本身就非常昂貴,還有用來分析RNA用的試劑盒也不便宜。如果附近有中心實驗室,也許可以借來用一下,不過肯定需要支付試劑盒的費用。

          所以,這就是為什么這是個"選擇"。跑個電泳和分光光度法測一下RNA的質量和得率有多高更實際。

          DNA污染:

          尤其是研究微生物基因的,因為引物沒法設計成跨外顯子接頭,RNA中的DNA污染就會很令人頭痛。On-Spin Column DNase removal systems在RNA洗脫前能高效地去除DNA。讓DNase滲入到濾膜中,在RNA洗脫前消化并去除DNA。但通常處理時間比較長。如果樣品或者細胞是儲存在RNALater或RNAProtect Bacteria Reagent里頭的話,DNA就更加不容易被DNase消化。這種情況下,更適合用DNase溶液處理。DNase可以與DNA充分接觸,而不用隔著濾膜奮力尋找DNA。但有個不好的地方是,在PCR前必須用EDTA或加熱法滅活。為了解決這個問題,我們開發出了DNase Max™ Kit,一款室溫也能穩定保存的高效DNase?梢杂锰貏e的DNase吸附樹脂輕易出去。對寶貴的RNA極其溫和,DNase的去除也極其高效。

          相關文獻:

          UltraClean Tissue & Cells RNA Isolation Kit

          Splice-Mediated Motif Switching Regulates Disabled-1 Phosphorylation and SH2 Domain Interactions

          Zhihua Gao, Ho Yin Poon, Lei Li, Xiaodong Li, Elena Palmesino, Darryl D. Glubrecht, Karen Colwill, Indrani Dutta, Artur Kania, Tony Pawson, and Roseline Godbout

          Mol. Cell. Biol., Jul 2012; 32: 2794 – 2808.

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