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          科研小技巧:機智地保護珍貴的RNA

          作者:Suzanne 來源:美國MoBio實驗室【字號:

          首先,無論RNA來源哪里,神經都必須繃緊,尤其是數量有限或非常珍貴的樣本。因為RNA非常不穩定,操作時動作要快,心要細。其實有好多方法可以在操作過程中保護你的RNA,讓你不至于那么焦慮。本篇將教你如何克服困難,更快更聰明地完成RNA提取。

          1、化學保護

          RNA的保護從第一步樣品的研磨開始。你可能已經注意到很多提取說明書都要求添加β巰基乙醇到裂解緩沖液。β巰基乙醇是種能不可逆地變性RNase還原劑,。所以當它的難聞怪味拒推銷人員于實驗室門外時,你卻沒辦法拒絕它,尤其是組織培養細胞。組織樣品中含有大量高活性的RNase,所以最好加上β巰基乙醇吧。

          如果提取過程中用到了苯酚,那么它能很好地替代β巰基乙醇滅活核酸酶。

          2、快速樣品均質化!

          下一步就是把含BME的裂解緩沖液(或基于苯酚的裂解試劑)與樣品混勻然后研磨。前面的文章我們討論過了樣品裂解均質化的問題,也對不同樣品使用什么樣的研磨珠套管有了充分了解。珠磨研磨能在同一條件下一次性均質化整批樣品,避免處理方法帶來的樣品間人為差異。

          為了保護你的RNA,切記快速做好這一重要步驟。當組織從冰箱拿出來,第一時間放入研磨管或其它容器中。此時組織開始化凍,RNase活性復蘇也開始計時。

          把組織樣品從冰箱取出組織樣品前,就要準備好帶裂解緩沖液的研磨管,把它們放到Stratacooler或類似的冷凍模塊上,靠著刻度條擺放,保持Tube管處于較冷的溫度。裂解緩沖液中含有較高濃度的硫氰酸胍鹽,在低溫的時候會沉淀。當樣品開始珠磨研磨時,產生的熱量會迅速溶解鹽溶液。較低溫度的Bead Tubes,可讓RNA的最大程度保持完整性。

          組織樣品一般以50mg分塊,用RNALater冷凍保存。通常每次提取我會加樣25mg,也就是說每次化凍一塊組織就能做兩次提取。一管樣品麻利地一切為二,放入已經預冷的研磨管。即樣品從冰箱到天平然后快速轉移到-20℃預冷研磨管。當所有樣品都灌入研磨管,再一起放上PowerLyzer上45℃兩個循環均質。所有被凍上的鹽會馬上溶解。

          快速研磨是為了讓所有細胞迅速暴露在裂解緩沖液和BME中,這一步很重要。如果裂解混合液中含有小塊細胞團,無論多小,仍帶活性的RNase會降低RIN值,電泳凝膠上也能看到降解的RNA。徹底的均質化非常重要。

          手提式的攪拌機也可以用來提取RNA,尤其適用于大提。30s就能打碎組織樣品。但是你一次只能弄一個樣品,其它所有的樣品就必須靜坐著等待?梢员3至呀饩彌_液低溫,切忌研磨前不要冷凍。

          3、DNA去除

          剩下的步驟相對簡單,如果起始樣品的質量就很好,此時洗脫下來的RNA也是質量很高的。那還有什么會引起RNA的降解或損失呢?對的,DNase消化步驟。

          DNase通常就在離心柱上完成,省去了事后處理的麻煩。但是,有些樣品含有太多的DNA(如脾、胸腺,甚至某些土壤),使得On-Column DNase并不都能非常有效地完全去除DNA。在這種情況下,對最終溶液進行DNase消化就很有必要。

          室溫穩定保存的DNase和DNase去除樹脂

          常規方法最后需要用EDTA和加熱來滅活DNase。但是他們都會影響RT-PCR。EDTA抑制RT-PCR酶反應,加熱RNA會降低其完整性。而且絕大多數DNase都需要冷凍保存,事先分裝減少反復凍融引起酶活性下降。

          我們自始至終都在建議整套系統來保護RNA。DNase Max™是個活性非常高的常溫保存液體DNase(1μl酶20min內能消化30μg DNA)。最贊的是DNase消化完成后的收尾步驟。DNase Max™還帶有DNase去除樹脂,它能吸附綁定DNase和陽離子與RNA樣品分離,使得不用添加帶抑制性的物質或加熱就能直接用于qRT-PCR。此樹脂效率很高,對反應液中10 units的酶處理效果(下圖條帶3-4)比另一種常用樹脂處理2 units的酶效果要好很多(條帶1-2)。

          這意味著你能盡可能地保護好經過數小時努力提取到的珍貴RNA,基因表達分析也能更準確。

          DNase Max™去除樹脂完全去除DNase。使用DNase Max™ kit和競爭對手的試劑盒消化樣品并去除DNase,然后用MOBIO的DNase-free認證方法檢測殘余DNase活性。條帶5為陰性對照,不添加DNase。樣品37℃孵育1h,65℃滅活5min。最終結果1%凝膠電泳展示。DNase Max™去除樹脂成功去除所有DNase(條帶3-4),而競爭對手的樹脂則失。l帶1-2)。

          總結

          當你了解哪里地方容易引起問題,RNA提取就變得容易多了。在加了保護劑的裂解緩沖液中快速研磨樣品是關鍵,然后輕柔地用DNase消化就更加簡單。

          是的,你還需要使用經過檢測認證的RNase-free的手套、實驗室清潔劑去去除工作臺和實驗設備上所有的核酸酶。在我們的實驗室里,這些都是最常規基礎的事情;疽剡包括RNA制備過程中使用的每種化學試劑、塑料制品和研磨珠。使用無論提取什么樣品的RNA,β巰基乙醇,快速的研磨,RNase-Free DNase消化與DNase去除樹脂都是你成功的每一環。

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