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          科研小技巧:分光光度法與熒光染色法在定量檢測DNA應用中的區別

          作者:Suzanne 來源:美國MoBio實驗室【字號:

          今天我準備討論一種可能在你整個科研生涯中一直都在用的常規方法。它是如此的基本、簡單,你可能根本沒在意。但我希望你在睡覺前能稍微想它一下。我要說的是什么?當然是質粒提取。

          質粒DNA提取作為實驗室常規實驗,你肯定很希望就算提取過程出錯了,依然能回收到DNA。但是,你回收到的真的僅僅是DNA嗎?事實上質粒提取是對兩種定量檢測DNA方法最有效的驗證:分光光度法 VS. 熒光染色法(Picogreen)。

          像大多數實驗室一樣,我們也用分光光度法定量檢測核酸。分光光度法簡單、靈敏,無需標準曲線。但是,當我們用分光光度法和Picogreen法定量檢測我們的質粒提取試劑盒與其它品牌質粒提取的質粒時,結果令人吃驚。再深入探討前,我們需要了解…

          質粒DNA提取作為現在最常規的實驗,你可能希望就算提取過程中盡管犯了點小錯,DNA還是能要回來。但是,你要回來的真的只有DNA嗎?碰巧的是,質粒提取是區分兩種DNA定量檢測方法之間區別的最好范例:分光光度法 VS. 熒光染色法(Picogreen)。

          在我們實驗室,我們也用分光光度法定量檢測核酸。它簡單、靈敏且不需要標準曲線。但是,當我們用分光光度法和Picogreen法比較提取的質粒的定量檢測結果時,對于我們的質粒提取試劑盒和競爭對手的盒子,結果非常驚訝。在我們做進一步分析前先了解一下Picogreen。

          什么是Picogreen?

          Picogreen是一種熒光染料,與雙鏈DNA特異結合后,能在485/530nm波段發出熒光?捎脽晒夥治鰞x或Qubit定量檢測樣品中的DNA含量。常用的分光光度法檢測260nm(A260)處的吸光值,缺點是光不能區分DNA和RNA、鹽、染色劑等雜質 是獲知含RNA的DNA樣品準確濃度的非常有用的工具。

          跟質粒制備有什么關系?

          還記得你加入到Tris重懸浮液的RNase嗎?它是用于消化為制備質粒而培養的健康的處于對數生長期的大腸桿菌中大量存在的RNA。然后,理想情況下,消化了的RNA從硅膠離心柱上洗掉,你只獲得高純度DNA。

          讓我們吃驚的是質粒DNA中有大量RNA污染。見下面的例子。使用瓊脂糖凝膠電泳,電泳中清晰看到RNA雜質的模糊條帶。

          *競爭品牌試劑盒需要需要在提取前往重懸緩沖液加入RNase A,MOBIO的試劑盒不需要

          但是,分光光度計中RNA雜質并不能像picrogreen那樣清楚顯示。

          如果你只用分光光度計檢測DNA,以及競爭對手的試劑盒,你肯定會覺得前面的試劑盒更好。凝膠上顯示他們得率是差不多的,但是分光光度計讀數讓你認為有雙倍的DNA。

          但是,picogreen卻給出了不一樣的結果。當有RNA存在的時候,原來2-3倍的假得率顯現了真實得率。使用MOBIO試劑盒,分光光度法得到的結果更接近實際得率。

          有何意義?

          這意味著當你酶消化樣品準備做克隆或寄送質粒用于測序前,你能準確地知道實際上有多少DNA。在對克隆結果排疑或者準確計算質粒插入率都有很大幫助。

          我知道并不是每個人都能用Picogreen檢測他們的DNA。而且并不都一定要知道準確的DNA量。我們也不常用這個方法,說實在的。只是請注意,當你看到質粒DNA凝膠底部有個模糊的條帶,你的質粒得率可能只有測量值的一半,做好相應的計劃準備即可;蛘咴囉肕OBIO的Plasmid DNA kit,你就是再也不用擔心了。

          我們也知道同樣的問題也會存在于基因組DNA的制備。我們的的建議是什么?至少用兩種方法檢驗DNA質量:瓊脂凝膠和分光光度法或picogreen。事實上只用一種辦法很難給你足夠信息確保下游實驗能是否成功進行。

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