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          DNA得率有問題?

          作者:Michelle Tetreault Carlson 來源:美國MoBio實驗室【字號:

          DNA的得率問題排在MOBIO收到的技術咨詢前五位。沉積物、棉拭子、廢水活性污泥等我們都聽說過未能提取到足夠DNA。畢竟DNA沒人會嫌多。

          當有人告訴我們他們沒能獲得足夠DNA的時候,我們首先排除一些常見的錯誤。比如因未能理解某個操作步驟而做錯了,或者選擇了一個不合適的試劑盒。也有可能是因為實驗室同事留給你的樣品在室溫下過夜卻沒有告訴你,諸如此類的原因可以列出很多很多。然而,真正的原因有可能很簡單,因為DNA得率低(這里說的低得率指的是低于用分光光度計,比如Nanodrop,檢測下限的濃度濃度)并不一定意味著操作過程出了錯,有可能一開始樣品中就沒有多少核酸,這種情況在棉拭子、濾膜和沉積物等生物含量較少的樣品中很常見。

          當你著手研究一個從未做過的樣品,你可能不太知道微生物的類型和微生物含量,因此也會不確定預期得率能有多少,尤其是野外采集的環境樣品。例如,每種土壤都有不同的pH、腐植酸含量、含碳量等。幸運的是,你并不需要摸黑前進,只要做一個對照即可。DNA yield2

          對于土壤樣本,最好陽性對照就是加入一定數量的細菌或者真菌到樣品中,然后嚴格按照試劑盒操作說明書做一次。細菌或真菌樣品可以自行過夜孵育制備。最好選擇希望在樣品中找到的代表性微生物。然后取1-2毫升培養物離心收集細胞。像大腸桿菌,1毫升過夜培養物大概含有10^9個細胞,能提取到約5微克DNA。真菌的細胞DNA含量大約是細菌的10倍。查查你實驗對象的基因組大小,測量一下培養物的細胞密度并對DNA的得率做出預估。然后,離心培養物收集細胞沉淀并用少量的中性緩沖液重懸,比如100μl生理鹽水,將重懸液混入土壤樣品中并在開始提取前至少孵育10分鐘。與此同時平行提取你的原始樣品。這樣從標準化的和沒有標準化的樣品之間的濃度差就可以判定樣品中含有多少DNA,如果行不通,可能是土壤中含有金屬等雜質干擾了樣本處理或者勻化不充分導致細胞裂解不完全等原因造成的。如果仍然搞不定,請聯系MO BIO的技術支持。

          其它樣本也可以做類似的標準化實驗,按你的標準將純培養物和處理樣本結合起來就行,例如,你正在過濾的池水,可以先用純培養的微生物標準化,再按既定的方法過濾處理樣本,這樣的話可以保證DNA提取方法是沒有問題的,測出樣品的濃度,又消除了一個未知因素。事實上,哪怕你對目前的提取方法已經很熟練了,也最好每次實驗都做這樣一個對照,這只需在試驗前期花費很少的時間,就很可能為你的下游實驗節省許多工作量。

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